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HCR v3.0 probe designer · 探针设计

粘贴转录本序列，自动判定链方向与编码区，按「编码区优先 + 间隔 GG/GC/CC/CG 偏好」排布互不重叠的探针对，并接上对应荧光通道的引发序列。全部计算在你自己的浏览器里完成，序列不会上传到任何服务器。

Distribution 探针分布方式
编码区优先：先按容量把探针对排进编码区，余下的按两侧 UTR 的容量比例分配，各自在自己所在区域里等距铺开（不会全挤到 3′ 端）；全长均匀：沿整条转录本等距铺开，不特别照顾编码区。两种模式下间隔 GG/GC/CC/CG 偏好都保留。
Thermodynamic stringency 热力学筛选档位
三档参数对照表 · Tier parameter table
参数 ParameterA 宽松 LenientB 中等 ModerateC 严格 Strict
结合区长度 Binding region25 nt25 nt25 nt
tile 跨度（一对）Tile span52 bp52 bp52 bp
成品探针长度（含引发序列）45 nt45 nt45 nt
GC 窗口35–70 %40–65 %40–65 %
同聚物上限 Homopolymer≤ 4 nt≤ 4 nt≤ 4 nt
Tm 窗口不筛（只算）50–65 °C 硬过滤50–65 °C 硬过滤
发夹 ΔG 门槛 Hairpin不筛≥ −2 kcal/mol≥ −2 kcal/mol
自身二聚体 ΔG 门槛 Self-dimer不筛≥ −6 kcal/mol≥ −6 kcal/mol
探针间二聚体门槛 Cross-dimer不筛不筛≥ −8 kcal/mol
串联重复上限 Tandem repeat不筛≤ 8 nt≤ 8 nt
最小间距 Min. spacing0 bp5 bp5 bp
间隔偏好 GG/GC/CC/CG加分（非硬条件）加分（非硬条件）加分（非硬条件）
选点准则 Placement间隔偏好 + 均匀+ Tm 向窗口中位靠拢同 B

三档共同的 Tm 计算条件：750 mM Na⁺（5× SSC）、30% 甲酰胺、探针链 500 nM。改其中任何一项，表里所有 Tm 与 ΔG 门槛的绝对含义都会跟着变。

ΔG 的评价温度是 ΔG°58.6，不是 ΔG°37。30% 甲酰胺把 Tm 压低 21.6 °C，等价于把「在什么温度下看这个结构」抬到 58.6 °C。按水溶液 ΔG°37 定门槛会系统性高估二级结构的稳定性——25 nt 结合区上实测平均差 1.8 kcal/mol（范围 0.96–3.86）。若你在别处看到的是 ΔG°37，这张表的 −8 大致对应 −10 到 −12。

计算对象不一样。发夹、自身二聚体、串联重复作用在 25 nt 结合区上——引发序列是固定的、四个通道都一样，不该影响位置选择。交叉二聚体作用在成品探针 45 nt 全序列上——两条探针互相粘的时候引发序列也在场。引发序列本身贡献一个组内共享、改不掉的常数地板：L·L −1.71、L·R −2.32、R·R −2.59 kcal/mol。门槛必须定在这个地板之下，否则被否决的会是「整类配对」而不是坏序列，筛选就失去了意义。

交叉二聚体只能增量复核。它是成对约束——一条探针能不能用，取决于同组里还有谁，既不能在扫描阶段预筛（那时还不知道选了谁），也塞不进全局 DP（状态得记住已选的全部探针）。做法是：以 DP 的最优排布为蓝本，从左到右逐对复核，每个位置优先原地不动，越线才在附近就近挪一个合格的位置。约束不触发时，输出与不开筛选时完全一致，所以 B 档与 C 档在没有冲突的序列上会给出同一套布点，B→C 的差别能干净地归因到交叉二聚体本身。挪不开时会少给一对，界面会写明。

为什么 B 与 C 的 GC 窗口故意相同。GC 和 Tm 高度相关，两条并存等于同一维度筛两遍，白扔自由度——实测把 C 的 GC 从 43–60% 放宽到与 B 相同的 40–65% 后，候选池从 289 涨到 685，对数、Tm 离散度、最差二聚体三项反而全变好。拉齐之后三档是干净的单变量阶梯：A 只做组成过滤 → B 加硬 Tm 窗口与单条探针的二级结构门槛 → C 只比 B 多一条交叉二聚体。

发夹与二聚体的 ΔG 是自算近似。只枚举完美互补茎，不含 bulge、内环、多分支与悬垂端，所以绝对值偏乐观（真实 Nupack / mfold 会算出更负的值）。排序与横向比较仍然成立，但不要当作绝对自由能引用。

Secondary probe(hairpin) modification 荧光通道(夹子修饰)
Binding-region QC 结合区筛选阈值

默认值 35–70% 是按常规转录本定的。像七鳃鳗这类 GC 整体偏高的物种，把上限提到 75–80% 才有足够可选位置；AT 富集的转录本则可能需要下调下限。改成什么值，取决于你这条序列本身的 GC 分布——上方容量提示会实时告诉你被跳过了多少。

Tm 计算条件

按 SantaLucia 1998 近邻参数 + Owczarzy 2004 盐校正计算，默认条件对应 HCR v3.0 杂交液（5× SSC ≈ 750 mM Na⁺、30% 甲酰胺）。三个前提必须知道：① 用的是 DNA/DNA 参数，而实际上靶标是 RNA，各家 HCR 设计工具（含基于 primer3 的）也都这么做，所以数值请用于同一条序列内部横向比较，不要当绝对值；② 盐校正的经验适用范围是 69–1020 mM Na⁺，低于 69 mM 属外推；③ 甲酰胺按 0.72 °C/% 折算，30% 就是约 22 °C 的降幅。Tm 与 GC 高度相关，开启硬过滤会与 GC 过滤叠加、明显减少可用位置。

逐步手算：这个 Tm 是怎么出来的（点开核对）

以文昌鱼 AmphiHox1 转录本设计出的第 1 对探针的 L 臂为例：GCTTATCTGTCGATATTACCACAAG（正义链 3–27 nt，25 nt，GC 40%）。以下按默认条件 750 mM Na⁺、30% 甲酰胺、探针链 500 nM 计算；如果你在上面改过这些值，数字会对不上。

① 拆二核苷酸，查近邻堆积参数　25 nt 有 24 个堆叠相互作用，逐个查表累加：

1 GC −9.80 −24.402 CT −7.80 −21.003 TT −7.90 −22.204 TA −7.20 −21.305 AT −7.20 −20.406 TC −8.20 −22.207 CT −7.80 −21.008 TG −8.50 −22.709 GT −8.40 −22.4010 TC −8.20 −22.2011 CG −10.60 −27.2012 GA −8.20 −22.2013 AT −7.20 −20.4014 TA −7.20 −21.3015 AT −7.20 −20.4016 TT −7.90 −22.2017 TA −7.20 −21.3018 AC −8.40 −22.4019 CC −8.00 −19.9020 CA −8.50 −22.7021 AC −8.40 −22.4022 CA −8.50 −22.7023 AA −7.90 −22.2024 AG −7.80 −21.00

每格：序号、二核苷酸、ΔH° (kcal/mol)、ΔS° (cal/mol·K)。
堆叠小计　ΔH° = −194.00 kcal/mol，ΔS° = −528.10 cal/(mol·K)。

② 加两端螺旋引发项　两端碱基都是 G，各按 G·C 引发项计（ΔH +0.1，ΔS −2.8）：
ΔH° = −194.00 + 0.1 + 0.1 = −193.80 kcal/mol
ΔS° = −528.10 + (−2.8) + (−2.8) = −533.70 cal/(mol·K)

③ 先算 1 M Na⁺ 下的 Tm（这里才是 Owczarzy 公式的输入）
两条链等浓度 → 有效浓度 CT/4 = 5×10⁻⁷ / 4 = 1.25×10⁻⁷ M
ln(1.25×10⁻⁷) = −15.8950　→　R·ln(CT/4) = 1.9872 × (−15.8950) = −31.5864
分母 = −533.70 + (−31.5864) = −565.2864
Tm = −193800 / −565.2864 = 342.835 K = 69.69 °C

④ Owczarzy 2004 盐校正 → 750 mM
GC = 0.4000，ln(0.75) = −0.2877
线性项 (4.29×0.4 − 3.95)×10⁻⁵ ×(−0.2877) = 6.4268×10⁻⁶
二次项 9.4×10⁻⁶ ×(−0.2877)² = 7.7795×10⁻⁷
1/Tm = 1/342.835 + 6.4268×10⁻⁶ + 7.7795×10⁻⁷ = 0.00292406
Tm = 341.990 K = 68.84 °C　（这一步只值 0.85 °C）

⑤ 减甲酰胺项
ΔTm = 0.72 °C/% × 30% = 21.6 °C
Tm = 68.84 − 21.6 = 47.24 °C　← 与输出表里第 1 对 L 探针的值相符

中间假设值多少

条件Tm
最终值（750 mM / 30% 甲酰胺 / 500 nM）47.2 °C
去掉甲酰胺68.8 °C
50 mM Na⁺（primer3 常用），无甲酰胺52.8 °C
探针链浓度 50 nM44.5 °C
探针链浓度 5 µM50.0 °C

真实原位杂交里探针是 nM 级，所以 44.5 °C 可能比 47.2 °C 更接近实情；但浓度每 10 倍只差 2.8 °C，远小于甲酰胺那 21.6 °C，也不影响探针之间的高低排序。